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Western Blot 常見問題分析(一)

發布時間:2019/7/16 6:31:05      閱讀次數:1125

Western Blot,通常我們在日常交流中說的就是簡稱“WB”,中文名稱是“蛋白印跡”或“免疫印跡”,其核心本質是抗原抗體的特異性反應。Western Blot的基本原理是蛋白質通過凝膠電泳后,按分子量大小順序在分離膠中分離開來,通過轉膜可將膠上蛋白質轉移到固相載體(通常是PVDF膜、NC膜和尼龍膜)表面,然后加入一抗去特異性結合膜上蛋白質,再加入酶或者熒光素標記的二抗,二抗與一抗結合反應后,通過底物顯色、化學發光等方法檢測目的蛋白。Western Blot實驗一般用來判斷特定蛋白在樣本中是否表達及粗略分析特定蛋白表達量的高低。



Western Blot是實驗室中常見且重要的一種分子生物學實驗方法,一次完整的實驗一般需要兩天時間,當我們對實驗結果滿懷期待or充滿信心,也許現實會給我們一記響亮的耳光。
 



下面,小科整理了一些Western Blot 結果常見問題:


/   條 帶 弱   / 

 


原因分析1:抗原量不足;

解決方案1:上樣前做蛋白定量,增大上樣量;

蛋白定量的意義:保證各處理組總蛋白上樣量一致,蛋白總量不足可能妨礙對目的蛋白的鑒定,蛋白含量太高會使條帶扭曲,影響電泳的分辨力;


原因分析2:蛋白質儲存過程中降解;

解決方案2:重新制備樣品;


原因分析3:膜錯誤選擇,轉膜不完全;

解決方案3:選擇合適的轉印膜:大蛋白(>20KDa)選大孔膜(0.45μm),小蛋白(<20KDa)選小孔膜(0.2μm);優化轉膜條件、時間、電壓。

轉膜中的要點和建議

轉膜具體情況 要點和建議
  大分子量蛋白   1)大的蛋白傾向于在膠里沉淀,阻礙轉移。在轉膜緩沖液里加入0.1%的SDS有助于解除上述現象;
  2)甲醇傾向于從蛋白上移除SDS,因此把甲醇濃度降到10%甚至更少,有助于減少上述沉淀現象,
  適用于大分子量蛋白轉膜;
  3)用4℃濕轉過夜代替半干法轉膜。
  小分子量蛋白   1)SDS阻礙蛋白和膜的結合,但小分子量蛋白受到的影響更大。若轉膜的蛋白很小,可以考慮去掉
  緩沖液里的SDS;
  2)保持甲醇濃度在20%;
  3)對于非常小的蛋白,不要用半干法。
  膜的方向確定   轉移后剪角做標記,分清正反面;用鉛筆做記號或電泳時Marker上成非對稱的。
  轉膜后背景高   選擇NC膜;另外,雞的抗體傾向于和PVDF膜及一些尼龍膜結合而導致高背景;可以換成NC膜以減
  少背景。
  轉膜時污染   避免手指觸碰膜,可以用鑷子來取膜。手指上的油脂和蛋白質會阻礙有效的轉膜,也會弄臟雜交。
  濾紙的大小   確保濾紙和膜的大小與膠一致。當使用半干法轉膜時,過多的部分會阻礙電流穿過膜。

原因分析4:抗體量不足;

解決方案4:增加抗體濃度,注意抗體儲存條件(避免反復凍融);

抗體的保存和使用:

1 收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存;

2 對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

    2.1 分裝的量以一次實驗用為好,最好不能少于10ul每份,因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能受到蒸發及管壁吸附的影響;

    2.2 復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來;

3 大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

任何時候,絕對避免反復凍融。


原因分析5:抗體孵育時間不足;

解決方案5:建議一抗4度孵育過夜;相對于2小時孵育,一抗4度過夜孵育會顯著增加抗體的結合。


/   條 帶 彎 曲  /   
 

原因分析1:條帶向上彎曲(︶ 條帶呈笑臉狀):凝膠制備不均勻,中間冷卻不好;
解決方案1:
分離膠配好后用水壓線,保證水平,配膠緩沖液現用現配,混合均勻后制膠。

原因分析2:條帶向下彎曲(︵ 條帶呈皺眉狀):可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡;
解決方案2:制膠架裝配好后,用水檢查是否有空隙再灌膠。
原因分析3:條帶顯示不均勻,中空:可能凝固太快導致聚合不均勻;
解決方案3:使用合適的促凝劑,制膠液混合好后及時灌膠


/   彌 散  /   

原因分析1:加樣過量;
解決方案1:降低上樣量,推薦每孔上樣20-30ug。
 

原因分析4:電極不平衡,加樣位置偏斜;
解決方案4:電泳槽水平放置,配膠時盡量小心,確保每個加樣孔完好無損。
原因分析2:蛋白降解;
解決方案2:使用蛋白酶抑制劑。
 
原因分析3: 樣品溶解不好;
解決方案3:樣品制備中一定要充分勻漿并超聲裂解。
 

原因分析5:樣品中含有不可溶顆粒;
解決方案5:緩沖液配好后過濾除菌,樣品裂解保證可溶性

更多實驗常見問題留待下次討論,敬請期待。

 

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